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一種含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物及其制備方法與流程

2020-04-22  zxscvbnm   |  轉藏
   
本發明涉及一種抗痛風組合物及其制備方法,具體涉及一種含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物及其制備方法,屬于中醫制藥
技術領域

背景技術
:痛風(gout)是一種由于嘌呤代謝紊亂,導致嘌呤代謝的終產物尿酸含量異常升高引起的代謝性疾病。痛風的特征是明顯的高尿酸血癥,尿酸鹽一水合物晶體在關節和腎臟中沉積,導致痛風性關節炎和尿酸腎結石。高尿酸血癥(hyperui~cemia)可被視為各種心血管疾病的臨床重要的危險因素。并且高尿酸血癥與癌癥、肥胖,胰島素抵抗,高血壓和血脂異常(代謝綜合征)也有聯系。嚴格控制尿酸水平是預防痛風和其他相關疾病的關鍵因素。葵花盤具有降尿酸、抗腫瘤、抗氧化、抗心絞痛、抑菌、鎮痛、降血壓等等多種療效,此外,葵花盤經提取得到的小分子肽更具有作用快,療效顯著,用量小等特點;薏苡仁,性味甘淡微寒,有利水消腫、健脾去濕、舒筋除痹、清熱排膿等功效;淡竹葉,有清涼,解熱、利尿及催產之效;白茅根,氣微,味微甜,涼血,止血,清熱,利尿;杜仲雄花,對于'強肝、補腎、通便、安眠、降三高'的效果尤為顯著;山楂,味微酸澀,具有降血脂、血壓、強心、抗心律不齊等作用。目前抗痛風藥物多以西藥為主,例如秋水仙堿、吲哚美辛、潑尼松龍、別嘌呤醇、非布索坦、丙磺舒、苯溴馬隆等,普遍存在毒副作用及不良反應,因此從植物中尋找療效好、毒性小的天然活性物質,是目前科研工作者亟待解決的問題之一。技術實現要素:有鑒于此,本發明提供了一種含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物及其制備方法,該組合物選用的原料均為藥食兩用,且取毒副作用的中藥,幾味協同合用利水滲濕、活血化癖、清熱瀉火、固本脾腎,具有顯著的降尿酸作用,從而到到治療痛風的療效。為了實現上述目的,本發明采用如下技術方案:一種含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物,其原料及其重量份數如下:葵花盤10~30份、薏苡仁20~60份、淡竹葉20~60份、白茅根20~60份、杜仲雄花20~60份、山楂20~60份;優選的,重量份數如下:葵花盤20份、薏苡仁40份、淡竹葉40份、白茅根40份、杜仲雄花40份、山楂40份。本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物原料組合依據如下:葵花盤藥性甘、寒,歸肝經,能夠平肝止血,清熱止痛,可用于治療高血壓、頭暈頭痛、耳鳴、子宮出血和瘡疹等疾病。現代藥理研究表明,葵花盤具有降尿酸、抗腫瘤、抗氧化、抗心絞痛、抑菌、鎮痛、降血壓等多種藥理活性。薏苡仁性味甘淡微寒,有利水消腫、健脾去濕、舒筋除痹、清熱排膿等功效,為常用的利水滲濕藥。薏仁又是一種美容食品,常食可以保持人體皮膚光澤細膩,消除粉刺、雀斑、老年斑、妊娠斑、蝴蝶斑,對脫屑、痤瘡、皸裂、皮膚粗糙等都有良好療效。淡竹葉根藥用,有清涼,解熱、利尿及催產之效;主治:胸中疾熱、咳逆上氣、吐血、熱毒風、止消渴、壓丹石毒、消痰、治熱狂煩悶、中風失音不語、痛頭風、止驚悸、瘟疫迷悶、殺小蟲、除熱緩脾。白茅根氣微,味微甜。主治:涼血止血,清熱解毒。用于吐血,尿血,熱淋,水腫,黃疸,小便不利,熱病煩渴,胃熱嘔噦,咳嗽。杜仲雄花,杜仲是雌雄雙株的樹,雄花就是杜仲雄樹開的花,科學研究發現:'杜仲雄花'特含60多種有效植物成分,如木質素類,環烯醚萜類、苯丙素類活性物質(如京尼平甙酸、綠原酸、桃葉珊瑚甙)、松脂醇雙糖甙、黃酮、生物堿、氨基酸、多糖以及礦質元素zn、mn、cu、fe、ca、p、b、mg、k等,杜仲雄花,匯集了所有杜仲的精華,可以說杜仲雄花具備植物杜仲所有的保健功效,而且對于'強肝、補腎、通便、安眠、降三高'的效果尤為顯著。本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物選用的原料均為藥食同源的中藥,葵花盤小分子肽與這些中藥提取物合用,協同作用良好,且無毒副作用,利水滲濕、活血化癖、清熱瀉火、固本脾腎,可以通過降尿酸治療痛風性關節炎,并具有抗炎、鎮痛的作用,解決了目前西藥治療痛風帶來的副作用大的困擾,可以長期服用,降低尿酸,從而治療痛風。本發明還提供了上述含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物的制備方法,步驟如下:(1)按上述的重量份數稱取各原料;(2)取葵花盤浸泡于葵花盤質量10~20倍的水中,閃式提取器提取5~15次,提取液離心10~30min,取上清液,復合酶酶解,過濾得到分子量小于10kd的提取液,溫度-40~50℃,壓力0.05~0.08kpa冷凍干燥得到葵花盤小分子肽凍干粉末;(3)取薏苡仁加薏苡仁質量10~20倍的水浸泡0.5~1h后,提取罐回流提取1~3h得到薏苡仁提取液;(4)取淡竹葉加淡竹葉質量10~20倍的水浸泡0.5~1h后,提取罐回流提取1~3h得到淡竹葉提取液;(5)取白茅根加白茅根質量10~20倍的水浸泡0.5~1h后,提取罐回流提取1~3h得到白茅根提取液;(6)取杜仲雄花加杜仲雄花質量10~20倍的水浸泡0.5~1h后,提取罐回流提取1~3h得到杜仲雄花提取液;(7)取山楂加山楂質量10~20倍的水浸泡后,提取罐回流提取1~3h得到山楂提取液;(8)將薏苡仁提取液、淡竹葉提取液、白茅根提取液、杜仲雄花提取液和山楂提取液混合,噴霧干燥后得到干燥提取物粉末;(9)將葵花盤小分子肽凍干粉末和干燥提取物粉末混合均勻后即得含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物。進一步,步驟(2)中以閃式提取器提取5~15次的操作,每次提取的時間為2~10s。進一步,復合酶為為胃蛋白酶和胰蛋白酶的混合酶,酶解的溫度為35~37℃,酶解時間為4~8h。具體實施方式下面將對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述,顯然,所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例,而不是全部的實施例。基于本發明中的實施例,本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例,都屬于本發明保護的范圍。實施例1含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物的制備方法,步驟如下:步驟一:葵花盤30份,15倍量水,閃式提取器提取5次,每次提取10秒鐘。提取液離心10分鐘,取上清液,復合酶酶解,過超濾裝置,得到分子量分別為大于10kd、10kd,小于10kd的提取液。將分子量小于10kd的提取液,經藥用真空冷凍干燥機進行干燥,得到葵花盤小分子肽凍干粉末;步驟二:薏苡仁60份,加入15倍量水,浸泡0.5h,提取罐中回流提取3h,得薏苡仁提取液;步驟三:淡竹葉60份,加入15倍量水,浸泡0.5h,提取罐中回流提取3h,得淡竹葉提取液;步驟四:白茅根60份,加入15倍量水,浸泡0.5h,提取罐中回流提取3h,得白茅根提取液;步驟五:杜仲雄花60份,加入15倍量水,浸泡0.5h,提取罐中回流提取3h,得杜仲雄花提取液;步驟六:山楂60份,加入15倍量水,浸泡0.5h,提取罐中回流提取3h,得山楂提取液;步驟七:將步驟二至六提取液合并,經噴霧干燥儀進行噴霧干燥,得干燥提取物粉末;步驟八:將步驟一與步驟七所得粉末混合均勻,得含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物。實施例2含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物的制備方法,步驟如下:步驟一:葵花盤20份,10倍量水,閃式提取器提取10次,每次提取5秒鐘。提取液離心30分鐘,取上清液,復合酶酶解,過超濾裝置,得到分子量分別為大于10kd、10kd,小于10kd的提取液。將分子量小于10kd的提取液,經藥用真空冷凍干燥機進行干燥,得到葵花盤小分子肽凍干粉末;步驟二:薏苡仁40份,加入10倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取2h,得薏苡仁提取液;步驟三:淡竹葉40份,加入10倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取2h,得淡竹葉提取液;步驟四:白茅根40份,加入10倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取2h,得白茅根提取液;步驟五:杜仲雄花40份,加入10倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取2h,得杜仲雄花提取液;步驟六:山楂40份,加入10倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取2h,得山楂提取液;步驟七:將步驟二至六提取液合并,經噴霧干燥儀進行噴霧干燥,得干燥提取物粉末;步驟八:將步驟一與步驟七所得粉末混合均勻,得含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物。實施例3含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物的制備方法,步驟如下:步驟一:葵花盤10份,20倍量水,閃式提取器提取15次,每次提取8秒鐘。提取液離心30分鐘,取上清液,復合酶酶解,過超濾裝置,得到分子量分別為大于10kd、10kd,小于10kd的提取液。將分子量小于10kd的提取液,經藥用真空冷凍干燥機進行干燥,得到葵花盤小分子肽凍干粉末;步驟二:薏苡仁20份,加入20倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取1h,得薏苡仁提取液;步驟三:淡竹葉20份,加入20倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取1h,,得淡竹葉提取液;步驟四:白茅根20份,加入20倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取1h,,得白茅根提取液;步驟五:杜仲雄花20份,加入20倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取1h,,得杜仲雄花提取液;步驟六:山楂20份,加入20倍量水,浸泡1h,提取罐中回流提取1h,,得山楂提取液;步驟七:將步驟二至六提取液合并,經噴霧干燥儀進行噴霧干燥,得干燥提取物粉末;步驟八:將步驟一與步驟七所得粉末混合均勻,得含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物。實施例4一、本發明實施例1中含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對人臍靜脈內皮細胞的增值作用的影響1材料與方法1.1實驗儀器與材料c02培養箱、低溫低速離心機(關國hemus公司);超凈工作臺(蘇州凈化設備有限公司);電熱恒溫水浴箱(上海精宏實驗設備有限公司);倒置顯微鏡(日本olympus公司);微量高速離心機(lahnet公司);全自動酶標儀(bio~red,usa);細胞培養箱(napco,usa);流式細胞儀(bd,美國)。dmem細胞培養液(gbico公司);0.25%胰蛋白酶(南京生興技術有限公司);小牛血清fbs(杭州四季青生物工程材料有限公司);二甲基亞颯dmso(分析純,上海凌峰化工);mtt(aeresco,美國)。huvec(人臍靜脈內皮細胞)由南京中醫藥大學基礎醫學院提供。1.2溶液的配置1.2.1尿酸鹽制備5g尿酸加100ml蒸餾水煮沸,加5%naoh溶液調ph7.4攪拌,冷卻析晶制成尿酸鈉結結晶。1.2.2dmem培養液尿酸鹽溶液制備將制好的msu10mg高壓火菌,加不含血清的dmem培養液10ml,研磨配成1mg/ml的dmem溶液。實驗時,此溶液再加dmem培養液配成不同濃度dmem的msu溶液。1.3實驗方法1.3.1huvec的體外培養huvec株經支原體檢測,無支原體污染,細胞經0.25%胰蛋白酶消化,含10%小牛血清的dmem培養液中和,離心(1000r/minx6min),去上清液,加含10%小牛血清的dmem培養液,移入細胞培養瓶中,放37℃、5%c02培養箱中傳代培養。1.3.2huvec活力檢測huvec在培養瓶中培養,待生長至70%~80%融合時,以0.25%胰蛋白酶消化、用10%小牛血清dmem培養液調成4x104/ml細胞懸液,植入96孔板(每孔200μl),培養24h,進行以下實驗,每組各8孔,分別用終濃度為0、25、50、75、100(μg/ml)的msu處理huvec,加液后繼續放37℃、5%c02培養箱中培養24h收集上清液,剩余的huvec用于測定細胞活性,每孔再加1mg/mlmtt液100μl,繼續放37℃、5%c02培養箱中培養4h后,棄mtt液,加入二甲基亞颯200μl溶解,震蕩,于酶標儀讀取吸光度值,波長490nm。2.實驗結果實驗結果見表1,以正常對照組細胞存活率(100%)為參照,本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物作用根據濃度(50μg/ml和100μg/ml、200μg/ml)時,表現出明顯的劑量依賴性,隨著劑量的增加,細胞存活率逐漸增強。經計算,作用24h后細胞存活率在濃度50μg/ml和100μg/ml、200μg/ml時分別達到41.21%±0.05%、47.84%±0.02%、54.34%±0.01%。結果表明,本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對huvec細胞具有一定的保護作用。表1含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對huvec細胞增值率的實驗結果藥物濃度μg/ml增值率200濃度54.34%100濃度47.84%50濃度41.21%二、本發明實施例1中含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對pc12細胞(來源于腎上腺嗜鉻細胞瘤)的保護作用1.細胞培養方法1.1pc12細胞的原代培養用已配制好的完全培養液在co2培養箱中進行常規培養pc12細胞株。co2培養箱中溫度、相對濕度、co2的相對濃度分別為37℃、90%、5%。每2天更換一次上述培養液,并使用倒置顯微鏡觀察各組細胞的狀態。1.2pc12細胞傳代待pc12細胞長滿培養瓶底3/4的狀態時,說明細胞生長是正常的且狀態比較好。在生物安全柜中,倒出原來的培養液,用一次性吸管吸取約2ml無菌pbs并來回晃動進行洗滌細胞,重復洗滌兩次。加入0.25%胰蛋白酶1~2ml進行消化(胰蛋白酶能覆蓋瓶底),可以輕輕拍打培養瓶側面,并在倒置顯微鏡下時刻查看細胞變化,當細胞間隙增大,細胞變圓且發生擴散時,迅速加入相同體積的完全培養液來終止此次消化,并使用一次性吸管將瓶壁上的細胞完全吹打下來后,全部移入離心管中。調節離心機的轉速為1000r/min,將離心管中的細胞懸液充分離心5分鐘后,吸去上清液。并吸取2ml完全培養液加入離心管中,輕輕吹打并混勻成單個細胞懸液,均勻的分裝至新的培養瓶中,并在各個培養瓶中分別加入2ml完全培養液,放入co2培養箱進行培養生長。1.3mtt實驗檢測葉酸對鉛暴露下pc12細胞增殖的影響1.3.1mtt原理mtt是一種能夠被活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶還原成難溶性的結晶狀紫色產物formazan的黃色染料,而無法在死細胞中發揮此功能。formazan在特定的溶劑(如dmso)存在情況下可以被完全溶解,在特定的波長下使用酶標儀等儀器能夠測定其吸光度,細胞增殖的越多越快則吸光度值(od值)越大,可間接反映活細胞的數量。1.3.2對pc12細胞增值率的影響挑取分化后細胞長勢較好的培養瓶,在其長滿瓶底3/4時,加入1~2ml胰蛋白酶來消化瓶底的pc12細胞,制成細胞濃度為5×105/ml的單個細胞懸液,于96孔板每孔加100μl細胞懸液,將處于培養板邊緣的各孔加入200μlpbs防止板中各孔培養液揮發。每組各8孔,分別用終濃度為0、25、50、75、100(μg/ml)的pc12細胞,加液后繼續放37℃、5%c02培養箱中培養24h收集上清液,于24h時后,分別從co2培養箱中取出一塊96孔板,每孔加入20μl之前配制好的mtt溶液,放入co2培養箱中反應4h后,拿出96孔板,置于生物安全柜下,將孔內的所有液體棄去,注意槍頭不要碰到96孔板各孔底部。最后每孔再加入150μl的dmso,將96孔培養板放置水平搖床中避光震蕩30分鐘后,在酶聯免疫檢測儀下,使用調零孔來調零,同時設置波長490nm來讀取并記錄各組od值。2.實驗結果見表2,以正常對照組細胞存活率(100%)為參照,本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物作用根據濃度(50μg/ml和100μg/ml、200μg/ml)時,表現出明顯的劑量依賴性,隨著劑量的減小,細胞存活率逐漸增強。經計算,本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物作用24h后細胞存活率在濃度50μg/ml和100μg/ml、200μg/ml時分別達到58.25%±0.05%、47.35%±0.02%、25.22%±0.01%。結果表明,本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對pc12細胞具有一定的保護作用。表2含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對pc12細胞增值率的實驗結果藥物濃度μg/ml增值率200濃度25.22%100濃度47.35%50濃度58.25%三、本發明實施例1中含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對raw264.7巨噬細胞的影響1.試驗方法1.1試劑的配置完全培養液:10%滅活胎牛血清+90%dmem高糖培養基,除菌,4℃保存。持續培養基:5%滅活胎牛血清+95%dmem高糖培養基,除菌,4℃保存。mtt溶液:50mgmtt粉末+10mlpbs,除菌過濾,~20℃保存備用。細胞凍存液:滅活胎牛血清和dmso以9:1均勻混合。1.2raw264.7巨噬細胞的復蘇、培養、傳代及凍存復蘇:凍存細胞取出后37℃速溶,取15ml離心管,加入10ml含血清培養基,將凍存管中液體(通常1~1.5ml)加入上述含培養基離心管中,輕吹混勻,1200r/min常溫離心5min,去掉上清,加入3ml含血清培養基,輕吹混勻得細胞懸液,加入培養瓶中,左右搖晃鋪平即可。培養:細胞置于含有完全培養基的培養瓶中貼壁生長,培養條件為恒溫37℃和5%co2。待細胞長滿培養瓶底部的80%以上,細胞可進行傳代。傳代:棄培養瓶內培養液,加入適量胰蛋白酶液消化使細胞單個分散,約1ml覆蓋培養瓶底即可。37℃孵育2~5min,若胞質回縮、細胞間隙增大,立即加入適量含血清的培養液,終止消化。順序反復地輕輕吹打瓶壁細胞,使貼壁的細胞脫離瓶壁懸浮形成細胞懸液。過程輕柔,防止用力過猛造成細胞損傷。血球計數板計數后,接于新的培養瓶(一傳三),放入培養箱培養。凍存:當細胞處于對數生長期細胞,按上述傳代方法制成細胞懸液,使細胞密度在5×107/ml左右,離心,去上清。細胞重懸于細胞凍存液,動作盡量輕,隨后分裝于無菌凍存管,1ml/管。密封凍存管,做上標記。凍存管以4℃10分鐘,~20℃30分鐘,~80℃過夜梯度凍存,最后投于液氮槽長期儲存。1.3本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對raw264.7巨噬細胞增值率的影響細胞接種于96孔板中,密度為2×105個/ml,加入100μl/孔,培養箱培養2h,細胞完全貼壁后,更換dmem維持培養液培養。正常組為不加lps和樣品液;lps組,培養液中加入lps使其終濃度為1μg/ml;樣品組,各樣品分別設置20~360μg/ml的濃度梯度。培養24h,每組做5個復孔。之后倒掉培養基,加入20μl/孔mtt溶液,37℃孵育4h。吸去孔中液體后加入dmso溶劑150μl/孔,酶標板孵育儀輕輕振蕩10min,之后540nm處檢測吸光度。2.實驗結果見表3,以正常對照組細胞存活率(100%)為參照,本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物作用根據濃度(50μg/ml和100μg/ml、200μg/ml)時,表現出明顯的劑量依賴性,隨著劑量的增加,細胞存活率逐漸增強。經計算,敖東復方作用24h后細胞存活率在濃度50μg/ml和100μg/ml、200μg/ml時分別達到15.2%±0.05%、16.2%±0.02%、23.7%±0.01%。表明,本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對raw264.7巨噬細胞具有一定的保護作用。表3含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物對raw264.7巨噬細胞增值率的實驗結果藥物濃度μg/ml增值率200濃度23.7%100濃度16.2%50濃度15.2%綜上所述,本發明中,葵花盤小分子肽與中藥提取物組方作用,具有協同效果,對人臍靜脈內皮細胞,pc12細胞,raw264.7巨噬細胞具有增殖作用,表明有保護作用,說明可明顯降低尿酸值,并具有抗炎、鎮痛的作用。此外,葵花盤、其他幾味中藥均有藥食兩用的,無副作用的特點,協同作用明顯,對治療痛風性關節炎效果顯著,可長期服用。本發明為中藥治療痛風提供了有效的方法及理論依據。表4含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物體外細胞實驗的綜合結果典型病例通過以下幾個典型病例進一步表明本發明的療效病例1李某,男30歲,常規體檢檢測尿酸值532,喝本發明實施例1含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物一個多月后,檢測尿酸值431.1,尿酸下降101,說明本發明含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物具有較低尿酸值的作用,且效果顯著。病例2吳某,男64歲,常規體檢檢測尿酸值494,喝了本發明實施例2含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物兩個月,復查檢測尿酸值287,已經降到正常范圍,并且大腳趾頭部位的痛風石已經完全溶解。病例3林某,男29歲,痛風5年,檢測尿酸值535,痛風每年都發作幾次,吃了本發明實施例1含葵花盤小分子肽的抗痛風組合物之后,檢測尿酸值降低到263,痛風石開始變小變軟。當前第1頁1 2 3 

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